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ISSN : 2288-1115(Print)
ISSN : 2288-1123(Online)
Korean Journal of Ecology and Environment Vol.49 No.4 pp.393-399
DOI : https://doi.org/10.11614/KSL.2016.49.4.393

Distribution of Toxic and Non-toxic Microcystis in Korean Water Supply

Kyung-Lak Lee1*, Yuna Shin1*, Jaean Lee1*, Jae-Kwan Lee1*, Han Soon Kim1*
Watershed Ecology Research Team, National Institute of Environmental Research, Incheon 22689, Republic of Korea
1Water Environment Research Department, National Institute of Environmental Research, Incheon 22689, Republic of Korea
2Department of Biology, Kyungpook National University, Daegu 37224, Republic of Korea
Corresponding author: +82-32-560-7451, +82-32-568-2051, micow1022@korea.kr
November 15, 2016 December 20, 2016 December 20, 2016

Abstract

This study was conducted to investigate whether the presence of mcy gene and microcystin production are related to morphological characteristics of Korean Microcystis species. We isolated 6 different species of Microcystis (M. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. flos-aquae, M. novacekii, M. viridis and M. wesenbergii) from drinking water supply dams (Yeongchun, Ankei, Gachang), and used microscopic method for morphological identification, molecular method for amplifying a partial region of mcyB gene and ELISA method for microcystin analysis. In the present study, 80% of M. aeruginosa strains contained mcy gene, followed by 45% (10 strains) of M. icthyoblabe, 33% (1 strain) of M. wesenbergii, and 11% (4 strains) of M. flos-aquae. Each percentage of mcy gene in Microcystis morphospecies was similar to that of microcystin production in Microcystis morophospecies. In conclusion, the present study shows that molecular method using mcy gene primers can be used as an indirect indicator for the monitoring of toxic cyanobacteria (Microcystis).


국내 주요 상수원지에서 독성 및 비독성 Microcystis의 분포 특성

이 경락1*, 신 유나1*, 이 재안1*, 이 재관1*, 김 한순1*
국립환경과학원 유역생태연구팀
1국립환경과학원 물환경연구부
2경북대학교 생물학과

초록


    서 론

    남조류는 전 세계 담수를 중심으로 광범위하게 발생되고 있다 (Bartram et al., 1999). Microcystin은 남조류가 생성하 는 대표적인 독소이며 (Sivonen and Jones, 1999), protein phosphatases type 1과 type2A의 활성을 저해함으로써 간 손상을 유발하는 것으로 보고되었다 (MacKintosh et al., 1990; Runnegar et al., 1995). 최근 고도정수 처리기술의 발 달로 먹는물에서 microcystin이 검출될 가능성은 거의 없 으나 여름철 호수나 강에서 수영, 수상스키, 보트와 같은 친수활동 시 microcystin에 노출될 수 있다 (Bartram et al., 1999). 최근에는 수생생물에 대한 microcystin의 위해성뿐 만 아니라 수생생물체 내 microcystin 농축에 따른 상위 먹 이단계 생물의 위해가능성이 보고되고 있다 (Ibelings et al., 2005; Romero-Oliva et al., 2014). 특히, 어류의 경우 microcystin에 의한 아가미, 소화관, 간 등의 손상이 확인된 바 있다 (Pavagadhi et al., 2013).

    Microcystin은 분자량이 900~1100 Da인 환상구조 를 지니는 펩타이드 (peptide) 계열의 물질이다 (Sivonen and Jones, 1999). Microcystin 생성은 10개의 유전자 (mcyABCDEFGHIJ)가 관여하며, 이들 10개의 open reading frames (ORFs)를 암호화하는 유전자의 크기는 약 55 kb에 달한다 (Tillett et al., 2000). 이와 같이 microcystin 생성유 전자의 발견은 잠재적 microcystin 생성 남조류의 검출을 가능하게 하였다 (Via-Ordorika et al., 2004).

    Microcystis속은 수화 (water bloom)를 유발하는 대표적 인 남조류이며, 동시에 microcystin을 생성하는 종으로 널 리 알려져 있다 (Sivonen and Jones, 1999; Sabour et al., 2002). 국내에서도 Microcystis속은 여름철 상수원지에서 수화를 일으키는 주된 남조류이다 (Lee et al., 2008). 지금 까지 Microcystis속은 유전자 (16S rDNA) 서열분석에 기초 했을 때, 종 수준에서 명확한 구분이 불가능하였다 (Otsuka et al., 2001). 반면에, Microcystis 종들 (morphospecies) 간의 명확한 구분을 가능하게 한 전통적인 형태학적 분류법은 이들 종들의 생리·생태학적 연구들을 수행함에 있어서 매우 유용하게 사용되고 있다 (Komárek and Komárková, 2002). 더욱이 형태학적으로 다른 Microcystis 종들 간에 microcystin 생성능의 차이가 보고된 바 있으며 (Kurmayer et al., 2002; Via-Ordorika et al., 2004), 독성 종과 비독 성 종의 비율은 수체에서 독소 농도의 변화에 영향을 줄 수 있다 (Vezie et al., 1998). 또한, 남조류 현존량의 증가는 microcystin 생성에 영향을 주지만, microcystin 농도와 반 드시 높은 상관성을 나타내지는 않는다. 이는 모든 남조류 가 microcystin 생성유전자를 갖고 있지 않기 때문이며, 환 경조건에 따라 종들 간에도 microcystin 생성 빈도 및 정도 가 다르기 때문이다. 즉, 주어진 환경조건에 대해 어떠한 종 이 우점하는가에 따라 microcystin 생성 정도가 결정된다 (Vezie et al., 1998; Ozawa et al., 2005). 따라서, Microcystis 의 형태학적 종들과 microcystin 생성 간 상관성이 존재한 다면 현미경검경에 의한 특정 종들의 확인만으로 주어진 수계의 microcystin 생성 정도를 간접적으로 예측해 볼 수 있다.

    본 연구는 국내 주요 상수원 호수에서 분리한 Microcystis 의 형태학적 종들을 대상으로 종들 간 microcystin 생성유 전자의 함유율 및 실제 독소 생성비율을 확인하고자 하였 으며, 동시에 Microcystis의 형태학적 동정으로 독소생성 가능성을 간접적으로 확인할 수 있는 방법을 제공하고자 하였다.

    재료 및 방 법

    1.시료 채집 및 종 동정

    남조류 시료들은 국내 주요 상수원지 (영천댐, 안계댐, 가 창댐)에서 플랑크톤 네트 (25 μm mesh size) 및 폴리에틸렌 병을 이용하여 2 L 원수를 채집하였으며, 채집한 시료들은 아이스박스에 넣어 실험실로 운반하였다. 남조류 동정을 위한 시료 (1 L)는 루골용액 (lugol’s solution)으로 현장에 서 즉시 고정하였으며, 실험실로 운반 후 100 mL로 농축한 후에 Sedgwick-Rafter counting chamber를 이용하여 현미 경 (Zeiss Axioskop 2, Germany) 400~1,000배 하에서 동정 하였다. 남조류의 동정은 Komárek (1991)Komárek and Anagnostidis (1999)을 참고하여 실시하였다.

    2.Microcystis 균주 분리 및 배양

    현장에서 채집한 시료를 대상으로 슬라이드 글라스 (Meridian, USA) 및 파스퇴르 피펫 (Pasteur-type capillary pipette)을 이용하여 Microcystis 균주들을 도립현미경 (Olympus JP/CK-2, Japan) 하에서 분리하였다. 분리된 균 주는 CB 배지 (Watanabe, 1996)가 함유된 배양플라스크 (Corning, USA)로 25℃, 약 30 μmol photons m-2 s-1의 연 속 광 조건에서 2주간 배양 (New Brunswick, Inova, USA) 하였다.

    3.Microcystin 생성유전자 분석

    Microcystin 생성유전자 (mcy gene) 검출을 위해 mcyB gene을 target으로 하는 primers (TOX2P/TOX2F)를 사용 하여 PCR 실험을 실시하였다 (Table 1).

    Microcystis 균주들 내 mcy gene의 검출을 위해 PCR 을 실시하였다. Microcystis 균주들을 연속적인 희석과정 을 거쳐 4,000 g에서 30분간 원심 분리하여 농축시켰다. 농 축된 시료 1 mL을 e-tube에 넣어 10,000 g에서 10분간 원 심 분리하여 상등액을 제거한 후, 멸균된 Milli-Q water (Millipore Corporation, USA) 1 mL로 희석하여 세포들을 세척하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 최종적으로, 세 척상등액 1 mL을 원심 분리하여 농축시켜 최종 용액을 100 μL로 하여 - 20℃에 보관하였다.

    PCR 증폭은 GeneAmp2400 thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, USA)을 이용하였다. PCR 반응액은 2.5 μL의 10× PCR buffer (Promega, USA), 1.5 μL의 MgCl2 (25 mM), 0.5 μL의 dNTP (2.5 mM), 0.2 μL의 BSA (12.5 mg mL-1), 1 U의 Taq DNA polymerase (Promega, USA), 2 μL의 주형 DNA 추출물을 혼합하였으며, 최종적으로 증류수를 이용하여 25 μL의 혼합액으로 조정하였다.

    PCR 반응조건은 95℃에서 3분 동안 초기 열처리에 이 어 95℃에서 30초, 각 primer쌍의 결합온도에서 30초, 72℃에서 3분을 주기로 하여 30 cycle을 반복하고, 마지막 으로 72℃에서 12분간 처리한 후 반응을 정지시켰다.

    PCR 생성물의 확인을 위한 전기영동은 1 mM의 EtBr을 포함한 TBE buffer (Promega, USA)에 녹인 1.2% agarose gel상에서 20~30분간 실시하였으며, DNA 밴드는 UV 램 프하에서 최종 확인하였다.

    PCR 생성물은 PCR purification kit (Bio Basics, Canada) 를 사용하여 정제하였으며, ABI Prism BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, USA)와 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 분 석하였다. 모든 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 검색 프로그램 (BLAST 2.1) 을 사용하여 GenBank에 등록된 자료들과 비교함으로써 mcy gene의 일치여부를 확인하였다.

    4.Microcystin 분석

    Microcystin 분석을 위해 Microcystis 조체를 초음파로 파쇄 후 실린지필터 (Whatmann, 0.2 μm)로 여과하였으 며, 제작사의 protocol에 따라 microcystin ELISA Plate Kit (EnviroLogix Inc., USA)를 이용하여 0.16~2.5 ppb의 검출 농도범위에서 microcystin 분석을 실시하였다.

    결과 및 고 찰

    1.Microcystis 분리 및 동정

    이번 연구에서 영천호, 안계호 및 가창호에서 Microcystis 속의 6종 (M. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. flos-aquae, M. novacekii, M. viridisM. wesenbergii)을 분리·동정하였 다 (Table 2; Fig. 1).

    Komárek and Anagnostidis (1999)가 제안한 형태적 특성 (군체의 형태, 세포 크기, 군체 주위의 젤라틴성 점액질층 등)에 기초하여 실시한 결과, 미동정종 Microcystis 1종을 포함한 134개의 Microcystis 균주들 중 M. aeruginosa가 69 개로 가장 많았으며, M. flos-aquae (36개), M. ichthyoblabe (22개), M. wesenbergii (3개), M. viridis (2개), M. novacekii (1개)를 분리하였다. 영천호에서 분리한 Microcystis sp.는 형태적으로는 M. ichthyoblabe와 유사하였으나, 세포 크기 (>5 μm)는 M. aeruginosa의 평균 세포크기에 가까웠다. 따라서, 미동정종으로 분류하였다. 이는 Microcystis 균주 들 중 군체의 형태 및 세포의 크기 등에 의해 Microcystis 종들 간의 중간형태가 나타난다고 보고한 Komárek (1991) 의 결과를 잘 반영하였다.

    2.Microcystis 종별 microcystin 생성 비율

    본 연구에서는 mcyB partial gene을 증폭시키는 primers (TOX2P/TOX2F)를 사용하여 Microcystis 종들의 mcy gene 유무를 확인하였다. 이전 연구들에서도 mcyB gene을 지닌 Microcystis 균주들의 높은 microcystin 생성 가능성이 제시 된 바 있다 (Neilan et al., 1999; Bittencourt-Oliveira, 2003).

    균주별로 M. aeruginosa는 80% (55개 균주)가 microcystin 생성유전자 (mcy gene)를 함유하고 있었으며, 그 다음으로 M. ichthyoblabe는 45% (10개 균주)의 함유율을 나타내었 다. 그 외에 M. flos-aquaeM. wesenbergii는 각각 11% (4 개 균주)와 33% (1개 균주)가 microcystin 생성유전자를 함 유하고 있었으며, M. novacekii (1개 균주)에서는 mcy gene 이 확인되지 않았다. M. viridis의 경우, 분리된 2개의 균주 들에서 모두 mcy gene이 확인 되었으나 소수의 균주들만 이 분리·동정되어 수치상으로 큰 의미가 없었다 (Fig. 2).

    Microcystin의 실제 생성을 확인하기 위해 ELISA 분석 을 실시한 결과, mcy 유전자를 지니지만 microcystin을 생 성하지 않는 균주들을 제외하고 M. aeruginosa 등 대부분 Microcystis 균주들은 microcystin을 생성하여 PCR 결과 와 큰 차이가 없었다 (Fig. 2). 반면에, 소수의 균주들은 mcy gene은 지니고 있으나, 실제로 microcystin을 생성하지 않 았다 (Fig. 2). 이전 연구들 (Nishizawa et al., 1999; Tillett et al., 2001; Kurmayer et al., 2004)도 Microcystis 균주들이 실제로 microcystin을 생성하지 않는 비활성화된 mcy gene 을 지닌다고 보고한 바 있다. 그 이유는 명확하게 밝혀진 바 없지만, 최근에 Rantala et al. (2004)는 진화과정에서 microcystin 생성 능력이 반복적으로 소실된 결과일 수 있 음을 보고하였다.

    자연 상태에서 Microcystis 개체들은 microcystin을 생 성하는 균주들과 생성하지 않는 균주들이 공존하고 있다 (Rohrlack et al., 2001; Kurmayer et al., 2002). 따라서, 개 체들 간 독성 및 비독성 균주 간의 비율 즉, microcystin 생성 비율의 차이는 수계에서 microcystin의 생성을 조절 하는 중요한 요소가 된다 (Vezie et al., 1998; Ozawa et al., 2005).

    이번 PCR 실험 및 ELISA 분석 결과들에 기초했을 때, 가장 높은 출현빈도를 보인 종들 중 M. aeruginosa 균주들 의 대다수 (75%)는 microcystin 생성을 하는 것으로 확인된 반면에, M. ichthyoblabeM. flos-aquae는 각각 41% (10 개 균주)와 8% (4개 균주)의 상대적으로 낮은 microcystin 생성비율을 나타내었다. 이는 M. aeruginosa가 다른 Microcystis 종들에 비해 microcystin 생성에 더 영향을 줄 수 있 음을 의미한다. 이전 연구들 (Kurmayer et al., 2002; Via- Ordorika et al., 2004)에 따르면, microcystin 생성에 관여하 는 mcy gene의 비율은 다른 Microcystis 종들과 비교하여 군체 형성이 용이하고 견고한 M. aeruginosa에 속하는 균 주들에서 더 증가하는 것으로 확인되었다. 이와 같이 mcy gene의 비율과 군체의 크기 간의 높은 상관성은 군체의 견고성과 관련성이 있는 것으로 생각된다. M. aeruginosa 는 매우 견고하고 큰 군체를 형성하며 성장하는 것으로 알 려져 있으며 (Via-Ordorika et al., 2004), 이러한 형태적 특 성들이 M. aeruginosa가 다른 Microcystis 종들보다 높은 microcystin 생성능을 지니는 데 기여한 것으로 판단된다.

    지금까지 Microcystis의 독성 균주와 비독성 균주는 mcy gene을 선택적으로 증폭시키는 PCR법을 통해 구분이 가능 한 반면에 형태학적 특성에 기초한 현미경 검경법 (micro microscopic method)으로는 그러한 구분이 불가능하였다 (Baker et al., 2002). 하지만 최근에는 Microcystis의 형태학적 특 성들과 microcystin 생성 간의 상관성에 대한 연구결과 들이 보고된 바 있으며 (Vezie et al., 1998; Otsuka et al., 2000; Kurmayer et al., 2002; Via-Ordorika et al., 2004), 각 나라마다 형태학적 종들 간에 microcystin 생성율은 큰 차 이를 나타내었다.

    이번 연구결과는 M. aeruginosa가 다른 Microcystis 종들 (M. ichthyoblabe, M. flos-aquae, M. wesenbergii)보다 microcystin 생성비율이 명확히 높다고 보고한 유럽의 다른 연 구들 (Via-Ordorika et al., 2004; Saker et al., 2005)과 유사 하였다. Via-Ordorika et al. (2004)은 유럽의 호수들에서 분 리한 M. aeruginosa 균주들의 70% 이상이 microcystin 생 성을 보이는 반면, M. ichthyoblabe 균주들의 microcystin 생성율은 20% 미만이며, M. wesenbergii는 microcystin을 생성하지 않는다고 보고하였으며, 가장 최근에 Saker et al. (2005)은 포르투칼의 수계에서 분리한 M. aeruginosa 균 주들의 62%가 microcystin을 생성한다고 하였다. 이에 반 해, Vezie et al. (1998)은 프랑스의 Grand-Lieu호에서 분리 한 98개의 M. aeruginos 균주들 중 16개의 균주 (16%)만 이 microcystin을 생성한다고 보고한 바 있다. 이는 지역적 으로 Microcystis 균주들의 microcystin 생성비율의 차이가 존재할 수 있음을 잘 보여준다. 또한 이러한 Microcystis 형 태학적 종들 간 microcystin 생성특성 (비율) 차이가 주어진 환경요인 (수온, 영양염, 광도 등)에 대한 반응성의 차이에 서 기인했을 가능성이 있으므로 이에 대한 추가적인 연구 가 더 필요하다.

    본 연구에서는 mcy gene primer에 기초한 분자생물학적 방법을 통해 국내 상수원지 (댐)에 발생하는 Microcystis의 형태학적 종들 간 mcy gene의 함유율 및 실제 microcystin 생성률의 뚜렷한 차이를 보여주었다. 이는 분자생물학적 방법과 더불어 현미경검경에 기초한 형태학적 종동정만으 로 Microcystis와 같은 유해남조류의 독소생성에 대한 간 접적인 정보를 제공할 수 있음을 보여준다. 반면, 본 연구 는 일부 소수의 상수원 댐들을 대상으로 한 결과이므로 향 후 수환경 조건이 다른 주요 하천에 적용하기 위해서는 추 가적인 관련 연구가 더 진행되어야 할 것으로 판단된다.

    적 요

    국내 주요 상수원지 (영천호, 안계호, 가창호)에서 분리 한 6종의 Microcystis (M. aeruginosa, M. ichthyoblabe, M. flos-aquae, M. novacekii, M. viridisM. wesenbergii)를 대상으로 microcystin 생성유전자 (mcy gene) 함유률 및 생 성률을 조사하였다. 조사 결과에서 M. aeruginosa는 80% (55개 균주)가 mcy gene을 함유하고 있었으며, 그 다음으 로 M. ichthyoblabe는 45% (10개 균주)의 함유율을 나타내 었다. 그 외에 M. flos-aquaeM. wesenbergii는 각각 11% (4개 균주)와 33% (1개 균주)가 microcystin 생성유전자를 포함하였다. 6종의 Microcystis에서 mcy gene의 함유율은 실제 microcystin 생성율과 거의 일치하였다. 특히, 가장 많 은 균주에서 mcy gene이 확인된 M. aeruginosa는 대부분 균주들 (75%)이 실제로 microcystin을 생성하는 것으로 조 사되었다.

    사 사

    본 연구는 2016년 국립환경과학원 조사연구사업 유해남 조류 측정방법 개선 연구 (I)의 일환으로 수행되었습니다.

    Figure

    KSL-49-393_F1.gif

    Microcystis strains isolated from water supply lakes. A: Microcystis aeruginosa (Kütz) Kütz 1846, B: Microcystis ichthyoblabe Kütz 1843, C: Microcystis flos-aquae (Wittr.) Kirchn. 1898, D: Microcystis novacekii (Kom.) Comp. 1974, E: Microcystis viridis (A. Br.) Lemm. 1903, F: Microcystis wesenbergii (Kom.) Kom. in Kondr. 1968, Scale bars: 20 μm (A~E), 10 μm (F).

    KSL-49-393_F2.gif

    Proportions of mcy gene (A) and microcystin production (B) in Microcystis strains. M.a.: M. aeruginosa, M.i.: M. ichthyoblabe, M.f.: M. flos-aquae, M.n.: M. novacekii, M.v.: M. viridis, M.w.: M. wesenbergii, M.sp.: Microcystis sp.

    Table

    PCR primers for gene amplification.

    List of Microcystis strains isolated from water supply lakes.

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