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ISSN : 2288-1115(Print)
ISSN : 2288-1123(Online)
Korean Journal of Ecology and Environment Vol.51 No.1 pp.16-28
DOI : https://doi.org/10.11614/KSL.2018.51.1.016

Prospect and Roles of Molecular Ecogenetic Techniques in the Ecophysiological Study of Cyanobacteria

Chi-Yong Ahn*
Cell Factory Research Center, Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB), 125 Gwahak-ro, Yuseong-gu, Daejeon 34141, Republic of Korea
Corresponding author: +82-42-860-4329, +82-42-860-4594, cyahn@kribb.re.kr
05/01/2018 31/01/2018 14/02/2018

Abstract


Although physiological and ecological characteristics of cyanobacteria have been studied extensively for decades, unknown areas still remain greater than the already known. Recently, the development of omics techniques based on molecular biology has made it possible to view the ecosystem from a new and holistic perspective. The molecular mechanism of toxin production is being widely investigated, by comparative genomics and the transcriptomic studies. Biological interaction between bacteria and cyanobacteria is also explored: how their interactions and genetic biodiversity change depending on seasons and environmental factors, and how these interactions finally affect each component of ecosystem. Bioinformatics techniques have combined with ecoinformatics and omics data, enabling us to understand the underlying complex mechanisms of ecosystems. Particularly omics started to provide a whole picture of biological responses, occurring from all layers of hierarchical processes from DNA to metabolites. The expectation is growing further that algal blooms could be controlled more effectively in the near future. And an important insight for the successful bloom control would come from a novel blueprint drawn by omics studies.



남조류의 생리·생태 연구에서 분 자생태유전학적 기법의 역할 및 전 망

안 치용*
한국생명공학연구원 세포공장연구센터 책임연구원

초록


    서 론

    담수에서의 독성 녹조 발생이 전 세계적인 문제가 되 기 시작한 이래, 이를 해결하기 위한 다양한 연구가 진 행되었다 (Harke et al., 2016b). 이를 통해 미세조류의 생 리 생태에 대한 이해가 깊어졌으며, 한편으로 녹조를 모 니터링하고 제어하기 위한 다양한 기술이 개발되어 왔다 (Srivastava et al., 2013; Paerl, 2014). David Schindler가 캐 나다의 226번 호수를 이등분하여 비교 실험함으로써, 인 (P)이 남조류의 생장에 질소 (N)보다 결정적인 역할을 하 고 있음을 밝혔고, 이는 육수학에서 매우 고전적인 연구결 과로 알려져있다 (Schindler, 1974). 이러한 연구결과에 따 라, 인의 유입을 차단하여 부영양화를 방지하고 녹조 발생 을 줄이고자 하는 노력이 전 세계적으로 이루어져 왔다. 특히 미국과 캐나다의 오대호를 중심으로 이루어진 공동 노력으로, 1968년 최대치를 보였던 점오염원의 인 유입량 을 10년 안에 절반으로 낮춤으로써 성공적인 녹조 제어 사 례를 보여주기도 하였다 (Makarewicz and Bertram, 1991).

    즉 녹조의 가장 근본적인 억제 대책은 이미 오래 전에 밝혀졌으나, 이의 실질적인 적용과 해결 여부는 여러 가지 요소에 의해 좌우되었다. 녹조 문제가 국민들의 실생활에 얼마나 심각한 불편을 야기하고 있는가, 그리고 이를 해결 하기 위해 국가가 가용한 경제력은 얼마나 있는가, 녹조 문제를 다른 환경현안보다 우선순위에 올릴 수 있는 의지 가 있는가 등에 의해 녹조 문제의 해결 정도는 달라질 수 밖에 없다. 이처럼 주요 원인과 해결책이 이미 제시되어 있는 상황에서, 녹조 제어가 다른 환경문제에 비해 긴급성 을 요구하지 않는 이상, 녹조 제어를 위한 연구에 더 이상 많은 예산을 투입할 필요성은 보이지 않았다.

    그러나 면적대비 인구가 많고 하수처리가 완벽히 작동 하지 않으며, 관리가 어려운 비점오염원이 주요 영양염류 유입원으로 작용하는 국가들에서는 여전히 녹조가 끊임 없이 문제되어 왔으며, 정도 차이는 있더라도 여전히 녹조 는 해결되지 않는 인류 공통의 환경문제이다 (Fig. 1). 국내 에서는 조류경보제를 통해 주간 모니터링으로 연간 지속 적인 감시를 수행하고 있으며, 4대강 사업 이후 국민의 관 심이 높아지면서, 모니터링뿐만 아니라 녹조 예측과 제어 에 대해서도 다양한 시도가 이루어지고 있다 (Ahn et al., 2011; Hong et al., 2014; Srivastava et al., 2015; Park and Hwang, 2016). 미국에서조차 2011년 이리호 (Lake Erie)에 서 극심한 녹조가 다시 발생한 이래, 녹조는 해마다 여름 철 연례행사처럼 일어나고 있다 (Michalak et al., 2013). 특 히 세계의 공장 노릇을 하며 온갖 환경문제를 다 떠안은 중국은, 2007년 태호 (Taihu)에서의 녹조 발생과 남조류 독 소로 인해 주변 도시의 수돗물 공급이 중단되는 사태를 겪 은 이후, 16조원 가량의 비용을 들이면서 녹조를 해결하기 위해 범국가적으로 다각적인 해결책을 찾고자 노력하였다 (Paerl et al., 2014). 이를 계기로 중국을 중심으로 남조류 와 녹조에 대한 연구가 다시 활발해졌으며, 아직도 남조류 에 의한 녹조 발생에 대해 미지의 영역이 많고, 다양한 접 근방법을 통해 새로운 해결책을 찾을 필요가 있다는 인식 이 보편화되기 시작하였다.

    예를 들면, 수중에 질소가 부족하더라도 질소 고정 남조 류는 공기중의 질소 가스를 유기물로 전환하여 사용할 수 있기 때문에, 질소보다는 인이 녹조 발생의 가장 중요한 인자로 오랫동안 인식되어 왔다 (Schindler et al., 2008). 그 러나 여름철에는 질소 고정보다는 탈질작용 (denitrification) 이 더 활발해지면서, 오히려 질소가 인에 비해 상대적으 로 부족하다는 연구결과가 최근 속속 발표되고 있다 (Paerl and Scott, 2010; Scott and McCarthy, 2010). 계절별 제한 인자가 여름에는 질소, 겨울철에 인으로 변화하고 있으며, 따라서 인의 제어만으로는 한계가 있고, 질소와 인을 동시 에 제거해야만 효과적인 녹조 억제가 가능하다는 인식이 점차 공유되고 있다 (Paerl et al., 2011). 또한 Harke et al. (2016a)이 이리호를 대상으로 transcriptome을 분석한 결 과, 인이 상대적으로 부족한 수역에서의 독성 Microcystis 의 우점도가 증가하였으며, 유전자 발현 관점에서 이에 대 한 이유를 제시하기도 하였다. 부영양화된 호소에서 인을 선택적으로 제한할 경우, 예상과 달리 독성 녹조의 발생을 오히려 촉진할 수도 있다는 결론이었다.

    이러한 예에서 알 수 있는 바와 같이, 녹조의 발생 과정 은 그리 단순하지 않으며, 이전에 생각했던 것보다 훨씬 다양한 요소가 복합적으로 작용하고 있음을 알게 되었다. 그리고 이러한 새로운 연구결과의 중심에는 분자생물학 기술의 발전에 기반한 오믹스 기법의 도입이 중추적인 역 할을 담당하고 있다.

    남조류 중에서는 Synechocystis의 유전체 염기서열이 1996년 최초로 밝혀졌지만 (Kaneko et al., 1996), 녹조 현 상의 가장 대표적인 Microcystis에 대한 유전체 염기서열 은 2007년 들어와서야 완성되었다 (Kaneko et al., 2007). 수질 환경에서의 중요성에도 불구하고 Microcystis의 유 전체 분석이 늦어지게된 이유는, 이들 유전체의 약 11% 가 inverted sequence로 구성되어 있어 완벽한 원형의 chromosome을 완성하기까지 기술적으로 까다로웠기 때 문이었으며, 유전자의 약 7% 이상은 유전자 재조합 과정에 관여하는 transposase로 구성되어 있어, 다른 어떤 박테리 아보다도 유전체 차원의 변이가 자주 일어나고 있음도 알 게 되었다 (Frangeul et al., 2008).

    본 총설은 따라서 남조류 연구에 있어서 분자유전학 적 및 오믹스 기법의 도입으로 어떠한 새로운 사실과 통 찰을 얻게 되었는지, 가장 대표적인 녹조 원인 남조류인 Microcystis를 중심으로 알아보고자 한다.

    Microcystis의 종 구 분과 독 성/비독성종

    Microcystis는 colony의 형태적 특징에 의해 전통적으로 5종으로 분류되어 있었으나, 박테리아의 종 구분 기준인 16S rDNA 유전자 유사성 97%와 DNA-DNA hybridization 70% 기준에 따르면 모두 한 종으로 통일하는 것이 타당 하다는 제안이 있었다 (Otsuka et al., 2001). 그리고 동일한 Microcystis 종이라 하더라도, 환경조건에 따라 colony 형 태는 가변적이라는 보고가 뒤따랐다 (Yang et al., 2006). 그 러나 형태적 차이와 유전적 차이를 연결시키려는 시도는 계속 있었으며, 16S-23S rDNA ITS (Otten and Pearl, 2011) 또는 cpcBA-IGS (Tan et al., 2010), 다당류 합성 유전자 (Gan et al., 2012; Xu et al., 2016) 등에 있어서, Microcystis wesenbergii는 다른 4종의 Microcystis와 확연히 구별된 다는 연구결과도 다수 발표되었다. 최근 박테리아 분류에 서 16S rDNA 염기서열을 서서히 대체하고 있는 것으로 알려진 average nucleotide identity (ANI)를 고려하면, 모 든 Microcystis는 한 종으로 묶어야 한다는 주장도 있어, Microcystis의 종 구분은 아직도 논란의 여지가 있다고 하 겠다 (Harke et al., 2016b).

    특정 Microcystis의 종 구분을 유전자 수준에서 하고자 하는 노력과 더불어, 독성종과 비독성종의 진화유전학적 분석을 통해 이들의 분화 과정을 알아보고자 하는 노력도 있었다. Microcystin 합성 유전자 (mcy)의 염기서열과 합 성과정은 밝혀졌으나 (Tillett et al., 2000), 독성종은 하나 의 그룹으로 묶이지 않고 다양한 그룹에 비독성종과 혼재 하는 양상을 보였다 (Otsuka et al., 1999). 이는 진화적으로 Microcystis의 공통 조상은 모두 mcy 유전자를 보유했다 가 점차 이 유전자를 상실하는 방향으로 진화가 이루어졌 기 때문이었음이, 다양한 housekeeping 유전자와의 염기서 열 비교 분석을 통해 규명되었다 (Rantala et al., 2004). 독 소 유전자의 유무가 유전적 유사성을 담보하지는 않았던 것이다.

    Microcystin의 실질적인 기능과 역할에 대해서는 많은 논의와 연구가 이루어졌음에도 여전히 정립되지 않은 상 태이다. Microcystin 합성 유전자를 잃어버리는 방향으로 진화가 이루어졌다면, microcystin이 세포내에서 결정적인 역할을 하지 않으며, 독소 합성 능력을 잃더라도 생존능력 에 큰 손실이 생기지는 않을 것으로 추정된다. 실제로 생 장 최적조건에서는 비독성 돌연변이의 경쟁성이 높은 사 례가 많다 (Jähnichen et al., 2007; Van de Waal et al., 2011; Zilliges et al., 2011). 최적 생장 조건에서 생존에 필수적이 지 않은 microcystin의 합성에 많은 에너지를 투입하는 것 은 경쟁에서 불리한 상황을 초래하는 것이다. 그러나 스트 레스 조건하에서는 생존력을 높이는 데 microcystin이 기 여한다는 보고가 있었으며, 일례로 산화 스트레스 조건에 서 microcystin이 단백질에 부착하여 안정성을 높임으로 써 protease로부터 보호하는 역할을 한다는 연구결과가 있 었다 (Zilliges et al., 2011; Meissner et al., 2013). 또한 높은 광도 배양조건에서의 metabolome 분석결과, microcystin이 대사경로를 조정하여 Microcystis의 적응성을 높이는 데 기여한다는 사실도 알게 되었다 (Meissner et al., 2015).

    독성종의 실험실 배양 기간 중 자연적인 돌연변이가 일 어나서 비독성종으로 바뀐 사례가 있는데, 이들을 실험실 과 호수에서 독성종과 경쟁실험을 한 결과, 독성종이 항 상 최종 우점하였다 (Schatz et al., 2005). 이 결과만 보아 서는 비독성종으로 돌연변이가 생기더라도 자연도태될 확 률이 높은 것으로 보인다. 그러나 이러한 경쟁실험은 조 건에 따라 결과가 달라지기도 하는데, 낮은 CO2 농도에 서는 독성종이, 낮은 광도에서는 비독성종이 우점하였다 (Van de Waal et al., 2011). 높은 광도에서 독성종의 경쟁 성이 증가하였고 (Phelan and Downing, 2011; Deblois and Juneau, 2012), 인 제한 조건에서는 비독성종이 우점하였 다 (Zhicong et al., 2015; Suominen et al., 2017). Anabaena 와의 경쟁실험에서는 Microcystis 독성종의 경쟁력이 높았 고, 비독성종의 경쟁력은 낮았다 (Li and Li, 2012). 포식자 인 Daphnia의 유무에 따라서도 결과가 달라지는데, 포식 자가 있을 경우에는 독성종과 비독성종 사이에 호혜적 관 계가 형성되면서 공존 가능성이 높아지기도 하였다 (Van Gremberghe et al., 2009).

    부영양화와 지구온난화가 심화될수록 독성종이 상대적 으로 경쟁에 유리하여 앞으로는 독성 녹조의 발생의 더욱 빈번하리라는 실험결과는 다수 발표되었다 (Paerl and Huisman, 2008; Davis et al., 2009; Rinta-Kanto et al., 2009; Joung et al., 2011). 이러한 경쟁실험도 독성종과 비독성종 의 최종적인 결과 판별에 독소 유전자의 분석이 필수적으 로 요구되는 바, 분자생태유전학적 기법을 사용함으로써 다양한 실험과 분석이 가능하게 되었다.

    남조류 유전형 (genotype)의 다 양성

    남조류 연구의 일차적인 관심은 인체에 위해를 줄 수 있 는 남조류 독소, 대표적으로 microcystin이었다. 그러나 어 떤 조건에서 microcystin의 생산이 증가하는지에 대한 연 구결과는 연구자마다 다르거나 심지어는 상반되는 경우도 많았다. 일반적이고 공통적인 결론을 이끌어내지 못하는 데에 대한 가장 설득력 있는 논리는, 연구자마다 실험에 사용한 strain 또는 유전형 (genotype)이 달랐다는 점이었다 (Rinta-Kanto, 2007). 유전체의 변이가 박테리아 중에서도 유독 심하다는 Microcystis에 있어서, 서로 다른 유전형은 생리적인 표현형 특성에서도 큰 차이가 있을 수 있음은 당 연한 현상이기도 하다. 그러나 이처럼 생리적 특성 차이가 큰 유전형이 다수 혼재되어 있음은, 단일한 제어대책의 수 립으로는 성공적인 녹조 제어가 현실적으로 어려울 수 있 음을 나타내기도 한다.

    그렇다면 실제 호소에서는 얼마나 다양한 유전형이 있으 며, 이들의 구성은 어떻게 변화하고 있는가? 일본의 카스 미가우라 호수 (Lake Kasumigaura)에서 1950년대 시료부 터 Microcystis 유전형 구성의 변화를 추적한 사례가 있다 (Tanabe and Watanabe, 2011). 이들은 7개의 housekeeping 유전자에 대하여 multilocus sequence typing (MLST)으로 유전형을 크게 7가지로 구분하였다. 2004년까지는 group A, B, D, E의 비중이 높았으나, 2005년부터 group G가 새 롭게 우점을 차지하면서부터 group A, B의 비중은 점차 줄 어들었으며, group D, E는 2007년부터 사라졌다 (Fig. 2). 대륙별 Microcystis의 유전형 분포 특성을 알아보고자 전 세계에서 수집된 311개의 Microcystis 유전형의 rDNA ITS 염기서열을 비교한 결과에서는, 대륙에 따라 눈에 띄는 차 이가 발견되지는 않았으며, 한 대륙 내에서의 다양성이 이 미 충분히 모든 대륙의 다양성을 확보하고 있었다 (Van Gremberghe et al., 2011).

    전 세계적으로 남조류의 유전형 분포에 어떤 지역적 특 성이 없는 반면, 한 호수 내에서는 계절별 우점 유전형이 바 뀌기도 한다. 대청호에서도 연간 Microcystis의 유전형 구성 이 변하였고 (Kim et al., 2010), 미국의 콥코 저수지 (Copco Reservoir)에서는 계절에 따라 우점하는 Microcystis의 유 전형이 극명하게 바뀌었으며 (Bozarth et al., 2010), 이리호 에서는 수역과 계절, 영양염류 농도에 따라 유전형의 구성 이 달라짐을 보여주었다 (Berry et al., 2017). 유전형에 따라 표현형도 달라지는데, 높은 탄소 농도에 적합한 형, 낮은 탄소 농도에 적합한 형 등 유전형마다 탄소 섭취의 방식 도 달랐다 (Sandrini et al., 2014). 다양한 유전형이 공존하 는 조건에서는 녹조의 발생 정도에 따라 전체 Microcystis 에서 독성 유전형의 비율이 변화하는데, 호소에 따라 독 성종의 비율이 높아지기도 하고 (Kardinaal et al., 2007; Davis et al., 2009; Joung et al., 2011), 감소하기도 하는 등 (Kurmayer and Kutzenberger, 2003; Kardinaal et al., 2007; Yoshida et al., 2007; Davis et al., 2009; Rinta-Kanto et al., 2009), 일반화하여 결론짓기는 어렵다. 대청호의 경우, 대 부분의 기간 동안 비독성종의 비율이 높았으나, 녹조가 심 해질수록 독성종의 비율이 상승하는 양상을 보였다 (Fig. 3).

    HPLC 또는 ELISA 키트 등을 이용한 microcystin 정 량 분석대신 mcy 유전자의 qPCR을 통해 수계의 독소 농 도를 간접적으로 산정할 수 있다는 보고가 다수 있었으 나 (Kurmayer et al., 2003; Hotto et al., 2008; Davis et al., 2009; Srivastava et al., 2012), 이러한 관계가 명확하지 않 다는 보고 또한 있었다 (Ye et al., 2009; Sabart et al., 2010; Guedes et al., 2014). 이에 대해서는 유전형별 독소 종류 와 합성률의 차이, 그리고 수계별 환경요인에 따른 유전 형 구성의 차이가 복합적으로 작용하여 이처럼 다른 결과 를 보이는 것으로 추측된다. 유전자가 실제 발현되는 정 도를 측정할 수 있는 real-time qRT-PCR기법을 사용하면, 단순히 존재하는 유전자가 아닌 발현되는 유전자를 정량 하므로 더욱 정확한 산정이 가능할 수 있다. 하루 중 낮 과 밤의 교체에 의한 유전자의 발현 변화를 이러한 기법으 로 추적한 결과에서는, 탄소 농도, 광도 등의 일주기 변화 에 따른 bicarbonate uptake, CO2 uptake, microcystin 합성, transcription regulator, photoprotection 등에 관련된 유전자 들의 일주기 발현 변화 특성을 알아 볼 수 있다 (Fig. 4).

    앞서 서술한 것처럼 독성과 비독성을 비롯하여 Microcystis의 유전형이 다양하고, 이들이 각각 환경요인에 대해 서로 다르게 반응하는 상황에서, 유전형에 대한 좀 더 깊 이있는 연구는 녹조 문제 해결에 어떤 실마리를 줄 수 있 을 것으로 점차 기대가 높아지고 있다. 그러나 2017년 7월 1일 기준, SCOPUS에서 “Title-Abs-Key (Microcystis) and Title-Abs-Key (genotype* or ecotype*)”의 검색식으로 논 문 검색을 해 보면, 지금까지 총 152개의 논문만이 발표 되었다. 반면, 앞선 검색식을 한국에서의 발표논문으로 한 정하여 “Title-Abs-Key (Microcystis) and Title-Abs-Key (genotype* or ecotype*) and Country (Korea)”으로 검색할 경우, 총 5편만이 검색된다. 아직까지 남조류의 유전형에 대한 국내 연구자들의 관심이 높지 않지만, 전 세계적으로 도 연구가 충분히 이루어지지 않은 상황이므로, 다른 분야 에 비해 기여할 여지가 많다는 점에 주목할 필요가 있다.

    박테리아 상 호작용과 오믹스 (Omics) 분 석

    Microcystis는 무균 (axenic) 상태로 만들거나 유지하기가 매우 까다로운 남조류로 알려져 있다. 공생관계에 있는 박 테리아로부터 생존에 필수적인 도움을 받고 있는 것으로 추정되는데, 박테리아와의 공존상태에서는 Microcystis의 광합성률, 엽록소 함량, 생장률, 다당류 합성 및 colony 형 성 등이 증가하였다 (Shen et al., 2011; Wang et al., 2016). 그러나 상황에 따라 박테리아는 경쟁이나 사멸을 유도하 기도 하며 (Fuks et al., 2005; Lee et al., 2010), microcystin 분해에 관여하기도 한다 (Maruyama et al., 2003; Lemes et al., 2008).

    녹조의 발생 단계별로 Microcystis와 공존하며 상호작용 하는 박테리아의 군집도 변화하게 되는데, 수년 전까지만 해도 DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) 또는 clone library 등을 이용하여 박테리아 군집분석을 수행하였 다. Parveen et al. (2013)은 남조류와 상호작용하는 박테리 아 군집을 비교하기 위해, 녹조 발생 단계별 Microcystis의 colony에 부착한 박테리아와 부유형 박테리아를 구분하여 clone library를 구축하고 분석하였다. 녹조가 사멸시기로 접어들수록 부착형 박테리아 군집에서는 Gammaproteobacteria의 비중이 높아지는 반면, Actinobacteria의 비중은 매우 낮게 유지되었다. 부유형 박테리아 군집은 이와 달 리 Actinobacteria의 비중이 상대적으로 높게 유지되었고, Gammaproteobacteria의 뚜렷한 상승세는 관찰되지 않았 다. 이처럼 기존의 분석기법으로도 박테리아의 군집분석은 가능하나, 많은 시간과 인력이 소요되는데 비해, 정량적 측 면에서 정확성이 떨어진다는 단점이 있다. 현재는 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS)의 비용이 급감하면서 대부분의 미생물 연구실에서 NGS의 사용이 점차 보편화되고 있다. NGS는 처음 상용화 된지 약 10년 만에 유전체 연구에 혁명을 가져온 것으로 평가된다. 박테 리아의 군집분석을 위해서는 16S rDNA 염기서열만 PCR 로 증폭하여 NGS 분석하게 된다. Shotgun metagenomics sequencing은 현장시료에서 추출된 DNA를 무수히 많은 조각으로 쪼개고 각각의 염기서열을 읽은 후, 컴퓨터 프 로그램을 통해 조각을 이어 붙임으로써 방대한 양의 모 든 DNA 염기서열 정보를 빠른 시간 안에 분석할 수 있다. MiSeq, HiSeq, PacBio 등 목적에 따라 다양한 방식을 선택 하여 사용할 수 있다.

    실험실에서 오랫동안 배양해 온 남조류의 박테리아 군집 과 현장 남조류 시료의 박테리아 군집을, pyrosequencing 기법으로 보다 정교하고 자세히 분석한 결과, OTU 수준 에서의 차이는 있었지만, Actinobacteria의 비중이 낮고, Gammaproteobacteria 비중이 높으며, 질소 고정능력이 있 는 박테리아 종이 많은 등, 두 군집 사이에는 상당한 유사 성을 보였다 (Zhu et al., 2016). 현장시료에서 호혜적인 박 테리아 군집이 실험실에서의 오랜 배양 기간 동안에도 유 지되었던 것으로 보아, 이들의 상호작용은 꽤 긴밀한 것으 로 판단되며, 앞서 언급한 Parveen et al. (2013)의 실험결과 와도 상당히 유사한 패턴을 보여주었다. 또한 우점하는 남 조류의 종에 따라 박테리아 군집은 큰 차이를 보여, 남조 류의 주요 대사작용 (특히 Anabaena의 질소 고정)과 유기 물의 종류에 박테리아 군집이 민감하게 반응하는 것으로 판단되었다.

    Shotgun metagenomics 방법으로 시료 내의 모든 DNA를 총체적으로 분석하는 경우에는, 특정 기능 유전자의 비중이 어떻게 변화하는지, 어떤 박테리아가 이러한 기능을 수행하 는지 알아낼 수도 있다. 가령 수돗물에 악취를 유발하는 이 취미물질 geosmin은 남조류뿐만 아니라 Actinobacteria, 우 산이끼, 아메바 종류도 생산하기 때문에, 원인종을 판별하 기 어려운 것으로 알려져 있다 (Jüttner and Watson, 2007). Otten et al. (2016)은 미국 체니 저수지 (Cheney Reservoir) 를 대상으로 shotgun metagenome 분석방법을 사용하여 geosmin은 Anabaena로부터, microcystin은 Microcystis로 부터 생산되고 있음을 보이고, qPCR로 이를 추가 확인하 였다 (Fig. 5).

    그러나 DNA 정보만으로 실제 현장에서 일어나고 있는 유전자 발현과 대사작용을 정확히 알 수는 없다. 이를 위해 서는 RNA, 단백질, 대사물질을 분석하기 위한 transcriptome, proteome, metabolome 등의 다른 오믹스 분석이 병 행되어야만 한다.

    Transcriptome 분석을 통해 질소, 인 제한 조건에서의 유 전자 발현 변화를 추적한 연구결과, 질소 제한 조건에서 urea transport, amino acid transport 등의 유전자 발현은 증 가하는 반면, 광합성 및 독소 합성 유전자의 발현과 microcystin의 함량은 동시에 감소하였다 (Harke and Gobler, 2013).

    질소 제한 조건에서 특히 대조구와 비교하여 transcriptome의 차이가 컸는데, urea를 질소원으로 공급할 때에는 transposase의 발현 증가가 두드려졌다 (Steffen et al., 2014). 하지만 인 제한 조건에서는 오히려 transposase의 발현이 정지하는 것으로 보아, 환경조건에 따라 transposase에 의 한 유전적 변이의 정도도 달라질 수 있는 것으로 보인다. 본 실험에서는 metabolome 분석도 동시에 수행했는데, transcriptome의 대대적인 변화에 비해 대사산물의 변화는 상대적으로 크지 않았다 (Fig. 6). 이러한 결과는, 환경 조건 이 달라지더라도 대사작용에서의 항상성 (homeostasis)을 유지시키기 위한 방향으로, 유전자 발현의 변화가 크게 일 어나는 것으로 사료된다.

    DNA microarray는 DNA chip이라고도 불리는데, 고체 표면 위에 각 유전자의 염기서열에 해당하는 DNA 조각들 을 집적하여, 많은 양의 유전자 발현 정도를 동시에 측정 하는 용도로 사용되었다. 이 기술에서는 mRNA를 cDNA 로 변환시키고, DNA chip 위에서 상보결합 반응시킴으로 써 대조구 대비 처리구의 유전자 발현 변화를 총체적으로 분석한다. 이러한 microarray 기술을 이용하여 명암주기 (L/ D cycle) 배양 조건에서 Microcystis의 transcriptome 변화 를 추적한 결과에서는, 암주기에서 명주기로 바뀌는 시점 에 유전자 발현의 변화가 가장 큰 폭으로 일어났다 (Straub et al., 2011). 명주기에서 탄소 흡수, 광합성, reductive pentose phosphate 대사, microcystin 합성 관련 유전자의 발현 이 증가하였고, 암주기에서는 glycogen 분해, oxidative pentose phosphate 대사, TCA 회로 관련 유전자의 발현이 증가 하였다. 싱가폴 크란지 저수지 (Kranji Reservoir)의 현장시 료를 이용한 Microcystis의 transcriptome 일주기 분석에서 는, 낮 동안 광합성과 에너지 대사 관련 유전자의 발현이 증가하였고, 밤에는 DNA 복제와 repair 관련 유전자의 발 현이 증가하였다 (Penn et al., 2014). 독소 microcystin 합성 에 관련된 polyketide/non-ribosomal peptide synthase (PKS/ NRPS) 유전자의 발현은 밤낮에 상관없이 꾸준히 발현되 었다.

    또 다른 metatranscriptome 분석에서는, Microcystis와 공 존하는 박테리아 군집의 구성이 바뀌더라도 기능적인 유 전자의 발현 양상은 90% 가량 유사하였다 (Steffen et al., 2015). 이러한 결과는, 박테리아의 군집 구조가 변하더라 도, 그 생태계에서 발현되는 기능 유전자의 구성은 유지된 다는 다른 연구결과와도 상응하는 것이었다 (Burke et al., 2011).

    오믹스 분석은 개별적으로 수행될 때보다, 병행될 경 우 더욱 신뢰성 높은 결과를 산출할 수 있다 (D’Agostino et al., 2016). 예를 들면, Microcystis가 다른 미세조류와의 경쟁에서 이길 수 있는 다양한 이유가 제시되어 왔으나, proteome과 metabolome의 동시 분석에 의해 좀더 구체적 인 기작이 최근 밝혀졌다. Microcystis는 linoleic acid를 배 출하여 Chlorella vulgaris의 생장을 억제하고, C. vulgaris 의 신호전달 물질인 nitric oxide를 흡수, 이용하여 positive feedback으로 linoleic acid의 방출을 더욱 증대시킴으로써 경쟁에서 이긴다는 연구결과가 발표된 것이다 (Song et al., 2017).

    그리고 생물정보학의 발전과 더불어 많은 양의 자료를 다양한 목적에 맞추어 쉽게 분석할 수 있는 계산 및 시각 화 기법들도 계속 개발되고 있다. 현장 시료의 NGS 데이 터가 통계적으로 유의미할 만큼 충분히 확보되어 있다면, 네트워크 분석을 통해 각각의 남조류 종이 어떤 박테리아 와 더 밀접한 상호작용을 하고 있는지, 이러한 관계도는 어떻게 되는지 그려볼 수 있다 (Fig. 7). 이러한 빅데이터 분 석기법은 생태계 구성원들 사이의 복잡한 관계를 보다 이 해하기 쉬운 방식으로 제시해 주며, 향후 남조류 생태연구 에 있어서도 핵심적이고 유용한 역할을 수행할 것으로 기 대되고 있다.

    그러나 오믹스 분석은 여전히 전통적인 연구방법의 병 행을 필요로 한다. 예를 들면, 남조류 군집을 NGS 분석 할 경우, 현미경 동정 및 계수와 다른 결과를 얻는 경 우가 많다. 가장 대표적으로는, 해양 남조류로 알려진 Prochlorococcus가 염기서열 분석상 담수에서도 가장 우 점하는 남조류로 나오는 것이다. 낙동강의 NGS 분석에서 도 (Hur et al., 2013), 미국 그랜드 호수 (Grand Lake)에서 도 (Morrison et al., 2017) Prochlorococcus는 우점도가 매 우 높았다. Prochlorococcus는 세포 크기가 매우 작기 때문 에, 담수에 실제 존재하더라도 일반적인 현미경 관찰로 다 른 남조류와 같이 동정, 계수하기는 어려울 것으로 보인다. NGS 결과의 검증을 위해서는 담수에서 Prochlorococcus 와 동일한 염기서열을 보이는 남조류 종이 먼저 분리, 배 양되어야 한다. 즉 전통적인 분리, 배양 방법과 오믹스 분 석 방법은 서로 상호보완하면서 더욱 강력한 도구로 사용 될 수 있을 것이다.

    오믹스 분석 있어서의 어려움은 그 동안 비용적인 측면 이 컸으나, 해마다 비용이 크게 감소하면서 비용은 점차 부차적인 문제로 여겨지고 있다. 현재로서는, 기능과 역할 을 모르는 유전자들이 여전히 너무 많다는 점과, 데이터베 이스에 축적된 자료가 꽤 늘었음에도 신뢰할 만한 충분한 양의 자료를 확보하는 데는 아직도 미흡하여 꾸준한 업데 이트와 개선이 요구된다는 점, 그리고 빅데이터를 효과적 으로 분석할 수 있는 분석툴의 지속적인 개발과 개선이 필 요하다는 점이 오믹스 분석에서의 주요 한계로 작용하고 있다.

    결 론

    육수학 연구에 있어서 현미경 관찰, 수질 분석, 현장 실 험 등 전통적인 기법을 통해, 오랜 기간에 걸쳐 매우 중요 한 발견들이 이어져 왔다. 이러한 기본적인 지식을 통해 수자원을 효과적으로 이용하고, 수생태계를 건강하게 유지 하기 위한 인류의 노력은 일부 성공을 거두어 왔다. 그러 나 녹조 문제를 중심으로, 가까운 미래에 해결이 쉽지 않 아 보이는 환경현안이 여전히 남아있음도 부정할 수는 없 다. 새로운 돌파구를 찾기 위한 새로운 시각과 접근법이, 이전의 어느 때보다 절실히 요구되는 시점인 것이다. 이전 과 비슷한 질문과 분석기법으로는 유사한 결론밖에 얻을 수 없다. 다행히도 분자유전학의 비약적인 발전으로, 특정 수생태계 안의 모든 DNA, RNA, 단백질, 대사물질을 총체 적으로 분석 가능한 오믹스 기법의 비용이 해마다 낮아진 덕분에, 점차 많은 연구자들이 큰 부담없이 접근할 수 있 게 되었다.

    수생태계는 환경요인과 바이러스, 박테리아, 식물플랑크 톤, 동물플랑크톤, 수서곤충, 어류, 인류까지 모두가 연결된 네트워크로 볼 수 있으며, 이러한 관점에서 빅데이터 분석 을 통해 기존에는 생각하기 힘들었던 새로운 정보를 추출 해 내는 것이 점차 가능해지고 있다. 그리고 이러한 과정 에서 핵심적인 역할을 수행할 것으로 기대되는 도구에 오 믹스 분석기술이 있는 것이다. 인간을 단일 생명체가 아닌 미생물과의 공생체로 보았을 때 보건 의학측면에서 더욱 효과적인 질병 예방과 치료가 유용한 것처럼, 수생태계의 구성원을 단독으로 분리하여 연구하기 보다는 다른 모든 구성원들과의 관계 측면에서 연구할 때 훨씬 풍부하고 정 교한 해석이 가능하다.

    거시적 측면뿐만 아니라 하나의 세포 안에서 일어나는 모든 미시적인 활동도 하나의 거대한 네트워크이다. 유전 자의 구성과 이들의 발현, 단백질의 합성과 분해, 대사활동 에 의한 다양한 대사산물의 생산과 변화가 이러한 네트워 크를 구성하며, 단일 유전자의 발현 조작 여부만으로는 알 수 없는 세포 전체의 반응을 분석해 내는 것 또한 점차 현 실화되고 있다.

    그러나 밝은 미래만 눈앞에 있는 것은 아니다. 남조류 의 유전적 다양성으로 인해, 같은 환경요인에 대해서도 유 전형마다 다른 반응을 보이는 경우가 많아, 공통된 결론에 기반한 일관된 대책을 수립하기 어려운 상황이 반복될 수 도 있다. 특정 호소에서의 현장연구 결과가 다른 호소에서 는 동일하게 관측되지 않는 것뿐만 아니라, 동일 호수에서 도 항상 똑같은 결과가 보장되지는 않는다.

    박테리아의 다양성은 남조류보다 압도적으로 높다. 남조 류는 특정 박테리아로부터 필수 비타민을 제공받거나, 산 화스트레스 경감을 도움받는 등 공생관계를 이루기도 하 고, 특정 박테리아는 남조류를 공격하여 사멸을 유도하기 도 한다. NGS 기술의 발전으로 남조류와 공존하는 박테리 아의 주요 구성원들을 알아내는 것은 점차 쉬워지고 있는 반면, 실제 일어나고 있는 상호작용을 인과적으로 설명하 기에는 아직도 구체적 증거의 확보가 미흡한 것도 사실이 다. 그리고 상호작용을 실증하기 위해 각각의 남조류, 박테 리아를 분리, 배양하여 실험실에서 증명하기 위한 단계에 서는, 이들의 분리와 배양이 대개는 쉽지 않다는 점도 큰 어려움 중 하나이다.

    분자생태유전학 분야의 급속한 발전이 이전에는 상상하 기도 어려운 복잡한 분석을 가능하게 해 주면서 수생태계 의 새로운 작동 원리를 알게 해 주었으나, 확증을 위해서 는 아이러니하게도 전통적인 연구기법의 도움을 더 요청 하고 있는 것이다. 결국 연구에 있어서도 학문적 다양성을 확보하고 이들 사이에 네트워크를 구축하는 것이야말로, 앞으로 한 단계 더 도약하는 데 우선 요구되는 선결조건이 라고 하겠다.

    적 요

    남조류에 대한 오랜 연구로 많은 사실을 알게 되었음에 도 여전히 미지의 영역으로 남아있는 부분이 많은데, 분자 생물학에 기반한 오믹스 기술의 발전으로 새로운 도구를 이용한 다른 관점에서의 연구가 최근 활발해지고 있다. 일 차적으로는 유전체 염기서열 분석기술을 사용하여 다양한 남조류의 유전체 비교분석과 유전자의 발현 양상을 연구 함으로써, 독소 합성의 조절 기작 등 생리적 특성이 나타 나는 원리 규명에 많은 노력이 기울여지고 있다. 또한 남 조류 유전형의 다양성과 이들이 밀접하게 상호작용하는 박테리아 군집이 계절적 및 환경적 요인에 어떻게 반응하 여 변화하고, 이러한 변화가 생태계에는 어떤 영향을 미치 는지에 대한 연구가 생물정보학 분석기법과 결합하면서, 생태계의 복잡한 작동방식에 대한 이해도 늘어나고 있다. 특히 다양한 오믹스 기법을 복합 적용함으로써 생태계 안 에서 일어나는 모든 층위의 생물학적 반응에 대한 총체적 그림을 그리는 것이 현실화되고 있으며, 이렇게 그려진 설 계도로부터 녹조를 효과적으로 제어하고 건강한 수생태계 를 유지할 수 있는 새로운 통찰의 가능성에 대한 기대가 고조되고 있다.

    사 사

    이 논문은 KRIBB 기관고유사업 및 2017년도 정부 (과학 기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단 해양극지기초 원천기술개발사업의 지원을 받아 수행된 연구임 (2016M1 A5A1027453).

    Figure

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    Status of worldwide occurrence of harmful algal blooms by Microcystis and its toxin, microcystin (Harke et al., 2016b).

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    Changes in the composition of Microcystis genotypes in Kasumigaura Lake, Japan (Tanabe and Watanabe, 2011).

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    Seasonal changes of toxic Microcystis proportion in Daechung Reservoir, 2006 (Joung et al., 2011).

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    Heatmap of daily succession of gene expression. Horizontal bar of grey scale indicates the daily change of light intensity (complete darkness from 22:30 to 05:00) (Sandrini et al., 2016).

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    Visual representation of assembled contigs and their relative read coverage depths for two samples collected at Cheney Reservoir, USA (S41 and S9). Contig colors denote taxonomic groupings at the level of order, with larger circles representing longer contigs. Contig clusters that represent the genomes of Anabaena and Microcystis are circled (Otten et al., 2016).

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    Metabolomic fold changes for treated samples compared with control samples. A, N-reduced (ammonium); N, N-reduced (nitrate); P, P-reduced; and U, N-reduced (urea). Bars represent log2 transformed fold intensity and directionality. Red indicates significant changes (P<0.05) (Steffen et al., 2014).

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    Network analysis on the relationships between cyanobacterial strains and bacteria. Colored symbols with large black border represent the cyanobacterial strains: orange circles, red hexagons, green triangles and blue rectangles represent respectively Aphanizomenon strains (A), Dolichospermum strains (D), Microcystis strains (M), and Planktothrix strains (P). Diamonds represent the bacterial OTU found in associated with cyanobacterial strains. The size of the diamonds is proportional to the relative abundance of the OTU (Zhu et al., 2016).

    Table

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