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ISSN : 2288-1115(Print)
ISSN : 2288-1123(Online)
Korean Journal of Ecology and Environment Vol.53 No.4 pp.344-354
DOI : https://doi.org/10.11614/KSL.2020.53.4.344

Molecular Identification of Pseudanabaena Strains and Analysis of 2-MIB Production Potential in the North Han River System

Keonhee Kim, Sejin Lee1, Kyunghwa Seo1, Soon-Jin Hwang*
Department of Environment and Health Science, Sanghuh College of Life Sciences, Konkuk University, Seoul, Republic of Korea
1Water Quality & Environment Center, Water Resources Management Dept, Hangang River Regional Division, K-water, Gwacheon, Republic of Korea
*Corresponding author: Tel: +82-2-450-3748, E-mail: sjhwang@konkuk.ac.kr
12/11/2020 11/12/2020 12/12/2020

Abstract


Identification of the target species of 2-MIB (2-methyllisoborneol) production is crucial in the management of off-flavor problem in the freshwater system. This study was conducted to identify 2-MIBproducing Pseudanabaena strains occurring in the North Han River system using molecular genetic method. Eleven phenotypes of Pseudanabaena were isolated from several mainstream sites of the North Han River, including Sambong-ri, Joam-myun, and Lake Uiam areas. Despite of morphological similarity of the strains, the phylogenetic analysis using 16S rDNA classified them into different species with low genetic similarity (40~55%). Isolated Pseudanabaena strains were converged to four species; Pseudanabaena cinerea, P. yagii, P. mucicola, and P. redekei. Among them, the 2-MIB synthesizing gene (mibC) was detected in P. cinerea, P. yagii, and P. redekei. However, actual 2-MIB production was detected only in P. cinerea and P. redekei based on gas chromatography analysis. This study is the first report of the molecular identification of Pseudanabaena strains and their 2-MIB production potential in Korea. The results of this study provides an evidence of species diversity of Pseudanabaena occurring in the North Han River.



북한강 수역에 분포하는 Pseudanabaena 균주의 동정 및 2-MIB 생산 잠재성 분석

김 건희, 이 세진1, 서 경화1, 황 순진*
건국대학교 상허생명과학대학 환경보건과학과
1K-water 한강유역본부 한강물관리처 물환경센터

초록


    서 론

    남조류에 의해 발생되는 이취미는 세계적으로 물 이용 에 상당한 어려움을 유발하고 있다 (Whangchai et al., 2017;Churro et al., 2020;Pham et al., 2020). 남조류가 생산하는 Geosmin과 2-MIB는 가장 대표적인 이취미 물질서, 국내에 서는 북한강 수계에서 2011년 겨울 (11~12월)에 Geosmin 이 비정상적으로 높은 농도 (1.64 ng L-1)를 나타냈으며 이후 2016년까지 지속적으로 북한강 수계의 여러 지점에서 검출 되었다 (You et al., 2013;HRWEMD, 2016). 2014년 이후로 북한강 수계에서 Geosmin의 발생농도는 점차 감소하였으며 2019년에는 팔당호와 의암호 수역에서만 일시적으로 낮은 농도가 검출되었다 (Byun et al., 2015;HRWEMD, 2019). 그 러나 2018년 11월에 의암호와 청평댐 하류 지역에서 2-MIB 가 고농도로 발생하였으며 이후 지속적으로 북한강 수계 여 러 지역에서 평균 50~100 ng L-1 정도로 검출되었다 (Byeon et al., 2018).

    2011년 북한강 수계에서 발생한 고농도 Geosmin은 Anabaena속 (屬) 남조류가 원인생물로 알려졌다 (Byeon et al., 2013). 특히 Anabaena crassaDolichospermum circinale (Anabaena circinalis)는 Geosmin 발생의 주요 원인종으 로 확인되었다 (Li et al., 2013;Kim et al., 2014). 이외에도 A. spiroidesA. macrospora의 세포밀도와 Geosmin 농도 가 통계적으로 높은 상관성을 나타내어 Geosmin을 생산하 는 종으로 추정되었다 (Cho et al., 1990;You et al., 2013). 그 러나 아직까지도 북한강 수계에서 2-MIB 발생의 원인종에 대해서는 명확한 종 동정이 이루어지지 않았으며 2016년 북 한강 수계에서 발견된 Pseudanabaena limnetica 세포 밀도 와 2-MIB 농도의 통계적 상관분석을 통한 원인종 추정만이 이루어졌다 (Byun et al., 2015). 2016년 이후 북한강 수계에 서 2-MIB를 생산하는 Pseudanabaena strain의 분리 및 동정 과 이취미 생산에 대한 연구는 Pseudanabaena yagii의 분리 및 genome sequence를 분석한 연구가 유일하다 (Jeong et al., 2020).

    Pseudanabaena속 남조류는 부유성과 부착성 (저서성) 생 활사를 나타낸다. 일반적인 세포 형태학에 기초할 때 (Jeong, 1993;Acinas et al., 2009;Park, 2012b), 세포 외부에 점액 질 초 (sheath)는 존재하지 않으며 사상체 (trichome)가 단 독생활을 하거나 매트를 형성하여 성장한다. 종에 따라서 10개 이상의 단일세포가 연결되어 긴 형태이거나 3개~5 개 세포가 연결된 짧은 형태를 보이며 단일세포 사이의 격 벽이 존재하며 협입되어 있다. 세포는 원통형으로 세포 폭 (width)이 길이 (length)보다 길며 성장 환경에 따라서 폭과 길이의 비율은 1.5~8.5배이다. 국내에서는 Pseudanabaena limnetica, P. mucicola, P. catenata, P. minima, P. westiana 가 발견되었으며 (Park, 2012b), 북한강 수역에서는 P. limneticaP. mucicola가 주로 우점하는 것으로 보고되 었다 (Byun et al., 2015;HRWEMD, 2016). 하지만 국내에 서 발견되는 Pseudanabaena 종들 간의 세포 폭과 길이 차 이는 0.5 μm~2.0 μm로 매우 작기 때문에 현장에 발생하 는 Pseudanabaena속의 종들을 광학현미경의 중~고배율 (200~400배)에서 명확히 동정하는 것은 매우 어렵다. 또한 다양한 환경조건에서 발생하는 형태적 변이로 인해 현미경 수준에서 정확하게 종을 동정하기는 쉽지 않다 (Kim et al., 2014). 뿐만 아니라 이취미 유전자 genotype에 따라서 동일 한 종 내에서도 이취미 물질을 생산하는 strain과 생산하지 않는 strain이 모두 존재하기 때문에 정확한 이취미 발생 원 인종을 판단하기 위해서는 유전자 수준에서 이취미 물질 합 성에 대한 잠재성을 반드시 확인할 필요가 있다 (Moustafa et al., 2009;Boopathi and Ki, 2014).

    본 연구에서는 북한강 수계에서 2-MIB가 발생하는 시기 동안 11개의 Pseudanabaena strain을 분리 및 배양하여 유 전자 수준에서 종 동정 및 2-MIB 발생 잠재성을 분석하였으 며 기체 크로마토그래피 (GC) 분석을 통해 동정된 종에 의한 실제 2-MIB 물질 생산을 확인하였다.

    재료 및 방 법

    1. Pseudanabaena strain의 분리·배양 및 형태적 특징 분석

    2019년 7월~2020년 7월 사이에 Pseudanabaena가 주로 발생하는 의암호 수역 (37°52′40.8″N 127°42′18.3″E)과 북 한강 수역 (37°30′14.4″N 127°17′27.1"E)에서 현장수를 채 수하여 저온 (4℃) 상태로 실험실로 운반하였다. 실험실에서 Capillary method (Guillard, 1975)를 이용하여 단일세포를 분 리하였으며, 분리한 단일세포는 BG-11 배지에서 온도 25℃, 광도 30 μmol-1 E-1cm2 (L : D=14 : 10)의 조건에서 1개월 이 상 배양하였다. 총 11개 Pseudanabaena strain을 분리하였으 며 1,000배율 현미경 (Axiostar A1, ZEISS, Germany) 하에서 단일세포 및 사상체의 형태적 특징을 관찰하고 사진기 (Axio cam 503 color, ZEISS, Germany)로 촬영하였다. 단일세포 및 사상체의 폭과 길이, 사상체의 단일세포 수는 현미경 전용 프 로그램 (ZEN ver.3.0, ZEISS, Germany)을 이용하여 측정하였 다. Pseudanabaena strain 들의 형태적 특징은 국가생물종목 록의 도감 (Park, 2012a, 2012b)을 참고하여 속 수준의 세포 크기 범위를 비교하였다.

    2. Pseudanabaena strain의 DNA 추출 및 PCR 증폭

    Blood and Tissue DNA extraction Kit (Cat No. 69504, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 실험실에서 배양된 Pseudanabaena 세포의 DNA를 추출하였다 (Miya and Sado, 2019). Lysis 용액으로 세포에 존재하는 DNA를 용출시켰 으며 용출 혼합액 1,000 μL를 micro column의 resin에 옮 겨 담고 원심분리하여 strain의 DNA만 흡착 및 분리하였 다. Resin에 흡착된 DNA를 2회 이상 정제하여 DNA의 순도 를 높였으며 최종적으로 100 μL Elution buffer를 첨가하여 DNA를 추출하였다. 정확한 종 단위 분석을 위하여 추출된 Pseudanabaena strain의 16S rDNA 유전자 구간에서 남조 류 특이적인 구간을 증폭하였다. 이를 위해 CYA106F (CGG ACG GGT GAG TAA CGC GTG) primer (Nübel et al., 1997) 와 CYA1280R (GCA ATT ACT AGC GAT TCC TCC) primer (Faldu et al., 2014)를 사용하였으며 TAKARA PCR machine 을 사용하여 95℃에서 5분 동안 가열한 후, 95℃에서 50초, 60℃에서 50초, 72℃에서 60초를 40회 반복한 뒤 72℃에서 5분 동안 가열하여 유전자를 증폭하였다.

    또한 Pseudanabaena strain의 Geosmin과 2-MIB 합성능 력을 유전자 수준에서 판단하기 위해 남조류의 Geosmin 합 성 유전자 구간 (gys1)과 2-MIB 합성 유전자 구간 (mibC)을 PCR 증폭하였다. gys1 유전자를 증폭하는 primer는 3139F와 3708R를 사용하였으며 (Wang et al., 2015) mibC 유전자를 증폭하는 primer는 mibC300F과 mibC300R primer를 사용 하였다 (Kim et al., 2020). 각각의 유전자를 PCR 증폭하기 위 해 TAKARA PCR machine을 사용하여 95℃에서 5분 동안 열처리 후, 95℃에서 50초, Annealing 온도에서 50초, 72℃ 에서 1분을 35~40회 반복한 후 72℃에서 5분 동안 열처리 하였다.

    PCR 증폭 산물은 E-gelTM Power Sanp Electrophoresis system (Thermofisher Scientific, USA)을 사용하여 2% agarose gel에서 전기영동하였으며 E-gelTM Power Sanp Camera (Thermofisher Scientific, USA)로 증폭 산물을 확인하였다.

    3. Gas chromatography를 이용한 2-MIB 검출

    북한강 수계에서 분리한 Pseudanabaena strain의 2-MIB (2-methylisoborneol) 물질 합성 검출은 HS-SPME (Head Space-Solid Phase Micro-extraction)법을 적용하였다 (Ding et al., 2014). 초음파로 세포가 파쇄된 시료를 직접 Gas chromatography에 주입하여 4분 동안 270℃에서 열 분리시 켜 GC/MS (Gas chromatography/Mass spectrophotometer. 450-GC, 320-MS, Bruker)로 분석하였다. Chromatography에 서 각 분석 성분의 체류시간 (retention time)에 해당하는 위치 의 봉우리 (peak) 면적을 계산하였다.

    4. 염기서열 분석 및 BLAST 검색

    PCR 증폭 산물의 염기서열 분석은 ABI BigDye® Termina- tor v3.1 Cycle-Sequencing kit를 이용하였다. PCR 증폭 산물 에 형광물질을 부착하였으며 이를 ABI 373 0XL DNA analyzer (Perkin-Elmer, USA)를 이용하여 PCR 증폭 산물의 염기 서열을 분석하였다 (SolGent, Korea). 유전자 염기서열 분석 을 위해 96°C에서 10초, 50°C에서 5초, 60°C에서 4분의 온 도 변화를 30회 반복하여 매회 발생하는 형광값을 분석하였 다. 분석을 통해 확인된 PCR 증폭 산물의 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) Genbank database에서 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 Genbank database에 존재하는 남조류 16S rDNA 유전자 및 이취미 물질 합성 유전자와 상동성 (Homology) 분석을 수행하였다. BLAST 분석에서 hit score와 염기 서열 일치율 (Percent of identity)을 모두 고려하였으며 최종 적으로 일치율이 98%를 넘는 종들 중에서 hit score가 가장 높은 종의 유전자로 동정하였다.

    5. 16S rDNA에 의한 유전자 염기서열 계통분석

    북한강 수역에서 분리 및 배양한 Pseudanabaena strain 의 유전자 염기서열의 특징을 파악하기 위해 NCBI에서 Pseudanabaena strain의 16S rDNA 유전자 염기서열 자료 를 내려받았다. 700 bp~1400 bp 크기의 유전자 정보를 대상 으로 하였으며 정확한 종명이 없고 species (sp.)로 구분된 자 료는 제외하였다. 유전자 염기서열의 계통수를 분석하기 위 해 Clustal W algorithm으로 strain 사이의 염기서열을 정렬 하였으며 Maximum likelihood 방법과 Neighbor-joining 방 법 (Saitou and Nei, 1987)을 사용하여 염기서열 사이의 계통 관계를 분석하였다. MEGA-X (Kumar et al., 2018) (window version 10.1.8)를 이용하여 분석을 수행하였으며 계통수 의 확실성 평가를 위해 bootstrap 방법 (1,000회)으로 계통수 를 검증하였다 (Felsenstein, 1985). Maximum likelihood와 Neighbor-joining 계통분석에서 염기서열의 치환모델은 각각 Maximum composite likelihood (Felsenstein, 1985) 모델과 Tamura-Nei (Tamura and Nei, 1993) 모델을 사용하였다.

    6. 염기서열 등록번호 (Accession Number)

    북한강에서 분리한 Pseudanabaena속 4종의 16S rDNA 유 전자 정보를 DDBJ (DNA database Bank of Japan)에 등록하 였으며 Accession 번호 LC582826 (Pseudanabaena cinerea), LC582827 (Pseudanabaena mucicola), LC582828 (Pseudanabaena yagii), LC582829 (Pseudanabaena redekei) 를 부여 받았다.

    결과 및 고 찰

    1. 북한강 Pseudanabaena strain의 형태적 특징

    북한강 수역에서 분리한 11개의 Pseudanabaena strain 세 포는 원통형 세포가 일렬로 연결되어 있는 사상성 (filament) 형태로 존재하였다. Pseudanabaena strain NHUA201911 를 제외하고 모든 세포는 원통형 단일세포 사이가 협입되 었으며 성장단계에 따라서 부유성 (Planktonic)과 부착성 (Attached)으로 구분되었다. 배양기간 동안 Pseudanabaena strain의 사상체 확인하였으나 사상체 안에서 휴면포자 (Akinete)와 이형세포 (Heterocystis)는 관찰되지 않았다. 사 상체는 최소 3개~22개의 단일세포로 구성되었으며 strain 사 이에 형태적 특징 및 성장 특성의 차이가 존재하였다 (Table 1, Fig. 1).

    NHUA201911 strain은 다른 strain과 다르게 세포가 50 μm 이상 길게 신장되었다. 원통형의 단일세포는 평균적으로 너비 2.8 μm±0.1 μm, 길이 4.5 μm±0.6 μm의 범위로 나타 났다. 의암호 수역에서 분리한 NHUA201911 strain은 세포 간의 협입이 관찰되지 않았으며 단일세포가 연결된 사상체 의 길이는 최소 54 μm부터 최대 102 μm로 다른 Pseudanabaena strain보다 2배 이상 긴 형태로 존재하였다. 또한 NHUA201911는 사상체끼리 뭉쳐서 성장하며 세포 자체가 부유하지 않고 바닥에 침전되어 성장하였다.

    NHUA202007-04, NHUA202007-05, NHUA202007-09 strain은 최소 9개~최대 17개의 단일세포가 연결된 사상체 형태를 유지하였으며 기낭을 통한 수직이동은 없었지만 교 반기 (Shaker)로 플라스크를 교반하였을 때 수층에서 부유 하였다. 단일세포의 너비×길이 비율은 NHUA202007-04와 NHUA202007-05 strain이 약 1.6~2.7배, NHUA202007-09 strain은 0.9~1.9배로 strain에 따라서 너비×길이 비율은 최 대 3배 차이가 존재하였다.

    NHUA201909 strain을 포함한 NHUA202007-04, NHUA 202007-05, NHUA202007-09 strain은 영양배지에 접종 후 약 1개월 동안 수층에서 부유성으로 성장하였으나 세포성 장이 진행됨에 따라서 1개월 이후 부터는 플라스크 바닥 에 부착하여 성장하는 세포가 함께 존재하였다. 1개월 이 상 배양한 결과 NHPD201909 strain을 비롯한 3개 strain (NHUA202007-04, NHUA202007-05, NHUA202007-09)은 부유성 특성과 부착성 특성이 모두 나타났다. NHPD201909 strain은 NHUA202007-04, NHUA202007-05, NHUA202 007-09 strain과 다르게 3개~5개의 세포가 연결되어 있는 짧 은 사상체 형태로 존재하였으며 영양염 배지 조건에서 일부 사상체는 5개 이상의 세포가 연결되어 사상체를 형성하였다. 세포크기는 너비 1.4 μm±2.4 μm, 길이 2.4 μm±0.7 μm로 너 비와 길이의 비는 약 1.6~3.0배였다. 양 끝단 세포는 원통형 으로 원뿔형에 가까운 둥근형이며 일반 영양세포의 길이보 다 약 1.2~1.5배 더 길며 강모 (setae)와 삭모 (calyptra)는 관 찰되지 않았다.

    NHUA202007-01을 비롯한 NHUA202007-02, NHUA 202007-03, NHUA202007-06, NHUA202007-07, NHUA202 007-08의 6개 strain은 사상체가 수중에 부유하였으며 일 부 사상체들만 바닥에 가라앉은 성장 특성을 나타내었다. 이러한 부유성 strain 안에서도 사상체의 형태 및 세포의 크 기 차이가 나타났다 (Table 1, Fig. 1). NHUA202007-01, NHUA202007-02, NHUA202007-03, NHUA202007-06, NHUA202007-07, NHUA202007-08 strain의 평균 세포크기 는 너비 2.2 μm±0.3 μm, 길이 4.8 μm±0.5 μm로 너비와 길 이의 비는 약 1.5~2.3배였으나 NHUA202007-08 strain은 너 비 1.5 μm±0.1 μm, 길이 2.7 μm±0.8 μm로 너비와 길이의 비는 NHUA202007-01, NHUA202007-02, NHUA202007- 03, NHUA202007-06, NHUA202007-07 strain과 유사하였 으며 세포의 크기는 더 작았다 .

    북한강에서 분리한 11개 Pseudanabaena strain의 세포는 성장 특성에 따라서 부유성과 부착성, 그리고 두 가지를 모두 나타내는 strain으로 구분되었으며 사상체의 길이가 긴 strain 과 짧은 strain으로 나뉘었다. 대부분 생물자원관 국가생물 종목록 도감 (Park, 2012a)과 여러 문헌 (Tuji and Niiyama, 2018;Shizuka et al., 2020)에서 설명하는 세포 크기 범위 에 포함되거나 유사하였다. 다만 NHUA201911 strain과 NHPD201909 strain을 제외하고 세포 길이의 비율 또는 단 일세포의 형태적 특징이 국가생물종목록 도감에서 설명하 는 내용과 완벽히 일치하지는 않았다. 이는 남조류 세포가 고농도 영양배지에 노출됨에 따라서 급격히 세포성장이 촉 진되었으며 이로 인해 현장수층에서 발생하는 남조류 세 포와 크기 차이를 나타낸 것으로 판단된다 (Jezberová and Komárková, 2007). 따라서 Pseudanabaena strain을 동정함 에 있어서 배양을 통한 형태적 특성만으로 종을 구분하는 것 은 부정확할 수 있기 때문에 유전자 수준에서의 동정이 요구 된다.

    2. 16S rDNA 염기서열 및 계통학적 특징

    북한강에서 분리한 11개의 Pseudanabaena strain의 유 전자 염기서열은 Genbank의 Pseudanabaena속 남조류 종 과 90%~100%로 하나의 계통군을 형성하였다 (Fig. 2). NHUA202007-02, NHUA202007-03, NHUA202007-04, NHUA202007-05, NHUA202007-06, NHUA202007-07, NHUA202007-09 strina의 16S rDNA 유전자는 60%의 계통 수 하나로 수렴한 반면에, 그외 다른 strain은 서로 다른 계 통수로 분리되었다. 하나의 계통수로 수렴된 NHUA202007- 02, NHUA202007-03, NHUA202007-04, NHUA202007- 05, NHUA202007-06, NHUA202007-07, NHUA202007-09 strain은 P. cinerea와 80% 이상의 유전적 유사도를 나타내 었다. 특히 P. cinerea Ak1349, P. cinerea Ak1548, P. cinerea NIES-4063 strain과 유전적 유사도가 98% 이상으로 매우 높 았다. NHUA202007-04, NHUA202007-05, NHUA202007- 09 strain 사이에서 유전적 유사도가 98~100%로 매우 높았 기 때문에 NHUA202007-02, NHUA202007-03, NHUA 202007-06, NHUA202007-07 strain과 유전자 염기서열이 서로 다르게 나타난 것으로 판단된다. 또한 NHUA202007- 08 strain은 P. yagii NIES4238 및 P. yagii NIES4237 strain 과 90% 이상의 높은 유전적 유사도를 나타내었으며 NHUA 201908 strain은 P. mucicola 종과 유전적 유사도가 90% 이 상으로 높았다. NHUA201911 strain 또한 P. redekei strain 들과 95% 이상의 매우 높은 유전적 유사도를 나타내었으며 NHUA202007-01 strain은 P. galeata CCNP 1313 strain과 97%로 유전적 유사도가 매우 높았다. 하지만 NHUA202007- 01 strain과 P. galeata CCNP 1313 strain의 계통수 길이는 통 계적인 유의성이 낮았다 (P>0.05). NHUA202007-01 strain 을 제외한 나머지 10개 strain은 모두 계통수의 길이는 통계 적인 유의성을 보였다 (P>0.05).

    동일한 종으로 구분된 NHUA202007-02, NHUA202007- 03, NHUA202007-04, NHUA202007-05, NHUA202007- 06, NHUA202007-07, NHUA202007-09 strain은 형태적으 로 매우 유사하였으며 배양과정에서 나타나는 특성 또한 서 로 유사하였다. 하지만 NHUA202007-04, NHUA202007- 05, NHUA202007-09 strain은 유전자 염기서열이 높은 상 동성 (90%)을 보였으나 계통수 길이에서 NHUA202007- 02, NHUA202007-03, NHUA202007-06, NHUA202007- 07 strain과 큰 차이를 나타내었다 (Fig. 2). 7개의 P. cinerea strain 사이에서 유효한 염기서열 916쌍 중 164쌍의 차이 (17%)는 P. cinerea의 종 내에서 유전적 변이 (분화)의 가능 성을 나타내고 있으나 이러한 strain 사이의 유전적 차이는 형태적인 특징으로 확인하기 어려웠다. 특히 NHUA202007- 07 strain은 NHUA202007-02, NHUA202007-03, NHUA 202007-06 strain과 분리된 계통수로 분화되었다. 하지만 이 러한 염기서열 및 이차대사산물 형성 차이를 P. cinerea 종 사 이의 변이로 결론을 내리기에는 보다 직접적인 증거가 요구 된다. 따라서 향후 P. cinerea strain 사이의 세부적인 염기서 열 분석과 생리학적 기능을 비교한다면 P. cinerea 종 사이의 변이에 대한 명확한 구분이 가능할 것으로 판단된다.

    3. 2-MIB 합성 유전자 (mibC) 유전자 염기서열 특징

    북한강 수역에서 분리 배양한 Pseudanabaena strain의 2-MIB 생산 잠재성을 파악하기 위해 각 strain의 DNA에 서 2-MIB 합성 유전자 (mibC)를 PCR 증폭하였다. 총 11개 Pseudanabaena strain 중에서 NHUA201911 strain와 NHUA 202007-07, NHUA202007-08 strain에서만 300 bp 크기의 유 전자 증폭 산물 band가 발견되었으며 3개 strain의 증폭 산 물 모두 남조류의 mibC 유전자 계통수에 포함되었다 (Fig. 3). GC 분석에서도 실제 2-MIB 물질을 생산하는 strain은 NHUA201911 strain과 NHUA202007-07 및 NHUA202007- 08 strain으로 확인되었다 (Fig. 4). NHUA201911 strain의 mibC 유전자는 Pseudanabaena sp. NIVA-CYA 111의 mibC 유전자와 82%의 상동성을 나타내었으며 NHUA202007-08 strain 및 P. yagiimibC 유전자와도 계통학적으로 매우 유 사하였다. NHUA202007-07 strain은 P. cinereamibC 유 전자와 계통학적으로 매우 밀접하였으며 P. galeataP. limneticamibC 유전자와 95%의 확률로 하나의 계통수를 형성하였다. 따라서 북한강 수역에서 발견되는 P. limneticamibCP. cinereamibC 유전자는 계통학적으로 정확 히 구분하기 어려우며, 수체에서 2-MIB 발생 원인종을 명확 히 파악하기 위해서는 mibC 유전자뿐만 아니라 16S rDNA 와 같은 종 특이적 유전자가 함께 분석되어야 한다. 또한 분 리된 Pseudanabaena strain의 mibC 유전자 분석결과에 기 초할 때 북한강 수계에서 발생하는 P. cinerea는 2-MIB를 합 성하는 strain과 비합성 strain의 두 개 genotype이 존재한다 고 판단된다. 이러한 genotype의 차이로 인해 동일한 분류군 이 우점하였음에도 불구하고 2-MIB 농도와 상관관계는 다 르게 나타날 수 있으며, 실제로 2019년 7월과 9월 사이에 의 암호에서 출현한 Pseudanabaena strain 세포밀도는 2-MIB 농도와 양의 상관관계를 나타내었으나, 동일한 시기에 팔당 호에서 출현한 동일한 Pseudanabaena strain의 세포밀도는 2-MIB 농도와 상관관계가 매우 낮았다 (HRWEMD, 2019). 이러한 genotype의 차이는 본 연구에서 분리된 P. yagiiP. redekei strain에서 모두 발생할 수 있으며, 향후 다양한 genotype의 2-MIB 합성 남조류 균주를 확보한다면 북한강 수역 에서 2-MIB 발생 특성을 보다 정확하게 설명할 수 있을 것 으로 판단된다.

    본 연구에서 분리한 NHUA202007-07 strain은 200,000 cells mL-1당 4,750 ng L-1 (0.023 pg cell-1)의 고농도 2-MIB 를 생산하였으며 동일한 분류군의 Pseudanabaena sp. FACHB 1277 strain (0.0076 pg cell-1)보다 3배 이상 높았다 (Zhang et al., 2016). 또한 대표적인 2-MIB 발생 분류군으로 알려진 Planktothrix sp. FACHB-1374 strain의 생산량 (0.033 pg cell-1)과 큰 차이를 나타내지 않았다 (Oh et al., 2017). 이 렇게 고농도 2-MIB를 생산하는 strain은 일본 (Niiyama et al., 2016;Shizuka et al., 2020)과 중국 (Zhang et al., 2016;Rong et al., 2018) 등 아시아 지역뿐만 아니라 미국 (Izaguirre and Taylor, 1998;Izaguirre and Taylor, 2004)과 유럽 (Giglio et al., 2011)에서는 보고된 바 있으나 국내에서는 본 연구 의 결과가 최초의 보고이다. 본 연구는 북한강 수계에서 발 생하는 2-MIB의 원인종 및 관리방안에 중요한 자료로서 활 용될 수 있을 것으로 사료되며 NHUA202007-07 strain (P. cinerea)와 NHUA201911 strain (P. redekei)를 활용하여 다 양한 환경조건에서 생리·생태적 연구가 진행된다면 북한강 수계에서 Pseudanabaena에 의한 2-MIB 발생을 보다 명확 하게 이해할 수 있을 것이다.

    적 요

    이취미 물질인 2-MIB를 합성하는 원인종에 대한 정보 는 담수생태계에서 이와 관련된 환경 및 경제적 문제를 해 결하는 데 필수적이다. 본 연구는 북한강 수계에서 출현하 는 Pseudanabaena strain을 분리·배양하고, 16S rDNA 염 기서열을 이용하여 종 수준의 동정과 2-MIB 합성 유전 자 탐색을 통해 이취미 물질 발생 잠재성을 분석하였다. 북한강 본류 지역 (삼봉리, 조암면, 의암호 지역)에서 분리 한 Pseudanabaena strain은 총 11개로서 NHUA201911과 NHPD201909 strain을 제외하고 단일세포의 크기는 서로 유 사하였다. 그러나 16S rDNA 계통분석을 통한 유전자 염기서 열의 유연관계를 분석한 결과, 분리된 strain들은 총 5개 종 (P. cinerea, P. yagii, P. mucicola, P. galeata, P. redekei)으 로 분류되었다 (40~55% 유사도). 2-MIB를 합성하는 mibC 유전자는 P. cinerea 07 strain (NHUA202007-07)와 P. yagii (NHUA202007-08), P. redekei (NHUA201911)에서만 발견 되었으며, 가스크로마토그래피 분석에 따라 실질적인 2-MIB 합성은 P. cinereaP. redekei 종에서 확인되었다. 본 연구 결과는 분자생물학적 수준에서 북한강 수역에서 발생하는 Pseudanabaena속 남조류의 다양도에 대한 증거를 제공하는 연구로서 북한강 수계에서 2-MIB 생산 원인종에 대한 중요 한 정보를 제공한다.

    저자정보

    김건희 (건국대학교 상허생명과학대학 환경보건 과학과 학술연구교수), 이세진 (K-water, 한강유역본부 한강 물관리처 물환경센터 과장), 서경화 (K-water, 한강유역본부 한강물관리처 물환경센터 과장), 황순진 (건국대학교 상허 생명과학대학 환경보건과학과 교수)

    저자기여도

    개념설정: 김건희, 방법론: 김건희, 황순진, 분 석: 김건희, 서경화, 자료제공: 서경화, 이세진, 원고초안작 성 및 교정: 김건희, 황순진, 원고검토: 황순진, 과제관리: 김건희, 연구비 수주: 황순진

    이해관계

    이 논문에는 이해관계 충돌의 여지가 없음.

    연구비

    본 연구는 2020년 한강수계관리위원회 환경기초조 사사업 (북한강수계 맛냄새물질 발생원인 조사 및 관리대책 수립)의 지원을 받아 수행되었습니다.

    Figure

    KSL-53-4-344_F1.gif

    Microscopic photos of Pseudanabaena strain isolated from North-Han River system (×1,000). Photos were taken from cultured samples. Scale bar=10 μm. ‘A’ and ‘S’ means apical cell and single cell, respectively. Black arrow (▶) indicated constrictions at cross walls in trichomes. (a): NHPD201908, (b): NHUA201911, (c): NHUA202007-01, (d): NHUA202007-02, (e): NHUA202007-03, (f): NHUA202007-04, (g): NHUA202007-05, (h): NHUA202007-06, (i): NHUA202007-07, (j): NHUA202007-08, (k): NHUA202007-09.

    KSL-53-4-344_F2.gif

    Phylogenic relationships of Pseudanabaena taxa inferred using Neighbor-joining and Maximum likelihood analysis. The analyses were based on partial 16S rDNA sequence (1,100 bp). Streptomyces cyslabdanicus strain K04-0144 was used as outgroup for the analysis. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) are shown next to the branches. Only bootstrap average value of 50% or higher are shown.

    KSL-53-4-344_F3.gif

    Phylogenic relationship of cyanobacterial mibC gene inferred using Neighbor-joining analysis. The analysis was based on partial mibC gene sequence (300 bp). Geosmin synthesis gene (geoA) of Nostoc sp. UK1 strain was used as outgroup for the analysis. The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1000 replicates) are shown next to the branches. Only bootstrap average value of 50% or higher are shown.

    KSL-53-4-344_F4.gif

    The 2-MIB concentration of among the isolated strains from North-Han River system. The red dot means the gene detection of odor (2-MIB) material synthesis. And bar graph means intracellular 2-MIB concentration. Each 2-MIB concentration was analyzed by gas chromatography (GC). PM: Pseudanabaena mucicola, PR: P. redekei, PC: P. cinerea, PY: P. yagii, PG: P. galeata.

    Table

    Comparison of morphological characteristics of Pseudanabaena strains isolated from the North-Han River system.

    Reference

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